供體細胞——克隆成功的關(guān)鍵

體細胞核移植技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，尤其是基因修飾大動物。供體細胞提供克隆胚胎的主要遺傳物質(zhì)，是體細胞克隆成功與否的關(guān)鍵因素之一。供體細胞的細胞形態(tài)、周期、活性以及供體的個體差異、性別年齡等都會對克隆效率有影響。正常機體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動態(tài)平衡狀態(tài)。外界環(huán)境刺激和機體內(nèi)氧化反應(yīng)代謝過程中產(chǎn)生大量活性氧（Reactiveoxygenspe-cies，ROS），對酶及轉(zhuǎn)錄因子的活化、mRNA表達等有較大的影響。有研究結(jié)果顯示SOD及CAT基因的mRNA表達水平出現(xiàn)改變，這可能與細胞抵抗外來刺激有關(guān)，但細胞的抗氧化能力是否發(fā)生改變，更準確的應(yīng)該在翻譯水平上對SOD及CAT基因的活性進行檢測。ROS對細胞膜或者DNA產(chǎn)生傷害，促使凋亡相關(guān)基因表達的改變而引發(fā)細胞凋亡。Bcl-2蛋白家族與p53基因是重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，兩者相互作用，調(diào)控細胞凋亡。當Bcl-2和Bax基因形成異源二聚體比例增加時，抑制細胞凋亡。結(jié)果顯示，G418處理后細胞Bcl-2/Bax基因的比例有所提高，促凋亡基因p53的表達量下調(diào)，這可能是細胞自身應(yīng)對G418所帶來的外來刺激而產(chǎn)生的一種自我保護，通過調(diào)節(jié)自身基因的表達，抑制細胞發(fā)生凋亡。

在體細胞核移植中，DNA甲基化是調(diào)控供體核內(nèi)重編程的一種方式，對恢復(fù)細胞的性、提高體細胞核轉(zhuǎn)移的效率具有重要意義。哺乳動物基因組中，轉(zhuǎn)座元件占到了50%左右，LINE是轉(zhuǎn)座元件中所占比例大的一種類型。LINE-1是LINE中的主要類型，在染色體中散在分布，約占小鼠和人類基因組的17%～20%。微衛(wèi)星是真核生物基因組重復(fù)序列中的主要組成部分，隨機、廣泛地分布于基因組中，大約占到豬全基因組的0.85%。因此LINE-1和微衛(wèi)星的甲基化水平基本可代表整個基因組的甲基化水平。Dnmt1和Dnmt3a分別是維持DNA甲基化和從頭甲基化的關(guān)鍵酶。研究表明，敲除小鼠的Dnmt1基因，會導(dǎo)致嚴重的基因組去甲基化或胚胎死亡;敲除Dnmt3a基因，小鼠在出生后4周內(nèi)死亡。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)G418處理后，核供體細胞的Dnmt1和Dnmt3a基因的mRNA表達量均顯著下調(diào)，表明G418會影響細胞內(nèi)重要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達，但不影響細胞整體甲基化水平G418處理核供體細胞對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響。71本研究經(jīng)高質(zhì)量濃度G418處理后的供體細胞進行核移植所獲得的重構(gòu)胚的融合率、卵裂率和囊胚率均顯著低于對照組，而囊胚細胞總數(shù)沒有顯著差異。這說明供體基因組的整體甲基化水平與克隆胚胎的發(fā)育能力可能沒有必然。這可能是核移植之后G418的毒性作用仍然存在于細胞內(nèi)，從而影響了細胞生長及克隆胚胎的發(fā)育性能。顧曉龍等利用RG108處理供體細胞并進行甲基化水平的檢測，發(fā)現(xiàn)供體細胞整體甲基化水平的改變可能對提高核移植效率沒有直接影響。Bonk等使用低密度甲基化芯片技術(shù)檢測克隆供體細胞、精子、克隆囊胚、體內(nèi)囊胚等的甲基化水平，同樣發(fā)現(xiàn)供體細胞整體甲基化水平的差異并非體外生產(chǎn)的囊胚發(fā)育率低下的主要原因，而某些區(qū)域特定的DNA甲基化修飾才是促進重構(gòu)胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。